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歐際醫(yī)藥依托擁有實驗動物使用許可證的實驗動物中心進(jìn)行合作,為您提供主要包括模型制備、受試物給藥、標(biāo)本采集、功能指標(biāo)檢測等技術(shù)服務(wù)。
服務(wù)目錄號:#OGF-011
服務(wù)項目:改善缺鐵性貧血功能評價
1 動物實驗
1.1 原理
用低鐵飼料喂飼動物可形成實驗性缺鐵性貧血模型,再給予受試樣品,觀察其對血液細(xì)胞學(xué)、血液生化
學(xué)等指標(biāo)的影響,可判定該受試樣品對改善動物缺鐵性貧血的作用。
1.2 實驗動物
健康初斷乳大鼠,單一性別,每組大鼠8-12 只。
1.3 低鐵飼料
配方:
1.4 劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設(shè)三個劑量組和一個低鐵對照組,以人體推薦量的5 倍為其中的一個劑量組,另設(shè)二個劑量組,必要時設(shè)陽性對照組(硫酸亞鐵或乳酸亞鐵,劑量為 2 ppm 或 2 mg/kg BW,以 Fe 元素計)。受試樣品給予時間 30天,必要時可延長至 45 天。
1.5 實驗步驟
1.5.1 建立缺鐵性貧血大鼠模型
選用健康斷乳大鼠在實驗環(huán)境下適應(yīng)3-5 天后飼予低鐵飼料及去離子水(或雙蒸水),采用不銹鋼籠及食罐,同時,采用剪尾取血法放血,5 天一次,每次 0.3-0.5ml。實驗過程中避免鐵污染。自第 3 周開始每周選取部分大鼠采尾血測 Hb,如多數(shù)動物 Hb 低于 100g/L 時,測定全部大鼠的體重及 Hb。
1.5.2 恢復(fù)實驗
選取Hb<100g/L 的大鼠作為實驗動物,根據(jù)貧血大鼠 Hb 水平和體重將其隨機(jī)分為低鐵對照組和三個實驗組,各組均繼續(xù)飼予低鐵飼料,低鐵對照組給予相應(yīng)溶劑,實驗組分別給予不同劑量的受試樣品,受試樣品給予時間 30 天,必要時可延長至 45 天,測定體重及各項血液學(xué)指標(biāo)。
1.6 觀察指標(biāo)
體重、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積/紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉。
1.6.1 血紅蛋白測定(氰化高鐵法)
消光系數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法任選其一測定血紅蛋白。在滿足實驗方案和儀器要求的前提下,也可采用血液分析儀測定。
1.6.1.1 吸光系數(shù)法
1.6.1.1.1 原理
血紅蛋白(haemoglobin,Hb)被鐵氰化鉀氧化后生成高鐵血紅蛋白,再與氰離子結(jié)合形成氰化高鐵血紅蛋白(紅色), 氰化高鐵血紅蛋白(紅色)極為穩(wěn)定,在 540nm 波長下,摩爾吸光系數(shù)為 44000,據(jù)此,用分光光度法測其光密度,運用吸光系數(shù)作血紅蛋白的定量測定。
1.6.1.1.2 儀器
分光光度計。
10 微升微量吸管。
1.6.1.1.3 試劑
稱取碳酸氫鈉(NaHCO3,AR)140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg,用水溶解并稀釋到 1000mL。貯存于棕色試劑瓶內(nèi),在暗處或冰箱(4℃)保存,至少可穩(wěn)定數(shù)月到 1 年。
1.6.1.1.4 實驗步驟
1.6.1.1.4.1 取試劑 2.5mL 于 5mL 帶蓋試管中,加入 10μL 血液,混勻后,放置 15 分鐘。
1.6.1.1.4.2 選用 0.5 厘米光徑比色杯,于 540nm 波長下,以試劑調(diào)零點,將所得樣品管之光密度乘以 736,
即為血紅蛋白濃度(g/L)。
計算公式如下:
Ct=待測的血紅蛋白(g/L)濃度。
= 氰化高鐵血紅蛋白在 540nm 波長下測出的光密度。
251 = 測定時血液的稀釋倍數(shù)(血 10μL 加入試劑 2.5mL 中)
44000 = 氰化高鐵血紅蛋白的摩爾吸光系數(shù)
0.5 = 比色杯的光徑
64458 = 血紅蛋白的分子量
1.6.1.1.5 注意事項
1.6.1.1.5.1 試劑不要放在聚乙烯瓶內(nèi),以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。
1.6.1.1.5.2 儀器因摩爾吸光系數(shù)法完全依靠儀器的吸光度來計算,故此法要求所用的儀器性能要符合要求(如儀器的波長準(zhǔn)確與否,以及靈敏度及線性等),否則將直接影響測定的結(jié)果。
1.6.1.1.5.3 儀器在使用前最好應(yīng)以 WHO 規(guī)定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正后再使用。參考液最好選用ICSH(國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會)確定的由 RIV(荷蘭國立公共衛(wèi)生研究院)制作的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫(yī)學(xué)化驗所制備的氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。
1.6.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法
1.6.1.2.1 原理
血紅蛋白(hemoglobin,Hb)在鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下生成極為穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白(紅色),其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計在 540nm 波長下,測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,測得待測樣品的吸光度后查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得 Hb 的濃度。
1.6.1.2.2 儀器
10μL 血色素吸管(或定量毛細(xì)管)
5mL 或 10mL 帶蓋試管
分光光度計1.6.1.2.3 試劑
稱取碳酸氫鈉(NaHCO3,AR)140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg,用蒸餾水溶解并稀釋到 1000mL, 貯存于棕色試劑瓶內(nèi),保存于 4℃冰箱可穩(wěn)定至 1 年。
1.6.1.2.4 實驗步驟
吸取2.5mL 試劑于 5mL 帶蓋試管中,用 10μL 血色素吸管(或定量毛細(xì)管)取大鼠尾血或靜脈血 10μL放置于已放入試劑的試管中;混勻放置 15min。選用 0.5cm 光徑比色杯,于 540nm 波長下,以試劑調(diào)節(jié)儀器零點,測定各樣品管的吸光度,同時測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度,繪制血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
查標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得待測樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的血紅蛋白含量(g/L),計算參考物質(zhì)的回收率。
1.6.1.2.5 注意事項
1.6.1.2.5.1 不要將試劑放在聚乙烯瓶內(nèi),以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。
1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系數(shù)方法計算血紅蛋白的含量,因為儀器的波長準(zhǔn)確與否、儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測定結(jié)果。
1.6.1.2.5.3 每次測定時,在不同間隔反復(fù)測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(低、中、高 3 個濃度)。
1.6.1.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
結(jié)果判定
受試樣品組與對照組比較,血紅蛋白濃度升高經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性,且受試樣品組前后升高幅度平均達(dá)到10g/L 以上,判定該實驗結(jié)果陽性。
1.6.2 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉測定
1.6.2.1 原理
血紅蛋白的合成過程中,幼紅細(xì)胞中的原卟啉在血紅素合成酶的作用下與鐵結(jié)合,當(dāng)鐵供應(yīng)不足時,紅細(xì)胞內(nèi)的原卟啉乃以游離形式累積起來超過正常水平。因此,檢測紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉(Free erythrocyteproloporphyrin,F(xiàn)EP)的含量是檢查缺鐵性紅細(xì)胞生成的有效方法。
血液樣品經(jīng)生理鹽水稀釋后,分別以乙酸乙酯:乙酸混合液(4:1)和 0.5N 鹽酸提取分離血中游離原卟啉,在一定波長下測定其原卟啉的熒光強度而定量。
1.6.2.2 儀器
1.6.2.2.1 熒光分光光度計或 930 型熒光光度計。
1.6.2.2.2 離心機(jī)。
1.6.2.2.3 混旋器。
1.6.2.3 試劑
1.6.2.3.1 肝素抗凝劑 一支 12500 單位的肝素以 0.9%生理鹽水稀釋至 25mL(1mL=500 單位)。
1.6.2.3.2 5 %(W/V)硅藻土生理鹽水懸濁液 稱取 5g 硅藻土加 0.9%生理鹽水至 100mL。
1.6.2.3.3 4:1 乙酸乙酯和乙酸混合液。
1.6.2.3.4 0.5N HCl。
1.6.2.3.5 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)液。
1.6.2.3.5.1 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)貯備液(50mg/L):稱取5mg 原卟啉,加4mL 無水乙醇使之溶解,以 1.5N HCl 稀釋至100mL。
1.6.2.3.5.2 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0mg/L):取2mL 原卟啉貯備液,以乙酸乙酯與乙酸(4:1)混合液稀釋到100mL。
1.6.2.3.5.3 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.1mg/L):取1mL 原卟啉中間液,以乙酸乙酯與乙酸(4:1)混合液稀釋到10mL。
1.6.2.4 實驗步驟
注:按上表依次加入各種試劑,在加入乙酸乙酯與乙酸混合液前,用混旋器混合已加入的混合液,然后邊混合邊加入乙酸乙酯與乙酸混合液。
離心15 分鐘,將各管上清液分別倒入 10mL 比色管中,每管加 4mL 0.5N 鹽酸,振搖 5 分鐘靜止使之分層,將上層溶劑抽出棄去,測定鹽酸液的熒光強度(30 分鐘內(nèi)比色)。
1.6.2.5 熒光測量
1.6.2.5.1 若使用日立 MPF-4型熒光分光光度計測定條件為激發(fā)波長為 403nm,狹縫10nm;發(fā)射波長為 605nm,狹縫為 5nm,液槽為 1cm 厚石英槽。
1.6.2.5.2 若使用國產(chǎn) 930 型熒光光度計測試,條件為激發(fā)濾光片 420,熒光濾片 550,靈敏度1×500,滿度開關(guān)開至最大,液槽為 1cm 厚石英槽,檢出靈敏度為 0.01μg/4mL。在不同量原卟啉(0μg,0.01μg,0.03μg,0.05μg,0.07μg,0.1μg)呈線性關(guān)系。
1.6.2.6 計算
1.6.2.7 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
結(jié)果判定
受試樣品組與對照組比較,紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉降低經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性,即可判定該實驗結(jié)果陽性。
1.6.2.8 注意事項
1.6.2.8.1 熒光強度隨時間延長而逐漸衰退,但 30 分鐘內(nèi)基本穩(wěn)定。
1.6.2.8.2 加乙酸乙酯-乙酸混合液時,一定要邊混合邊加入,否則影響測定結(jié)果。
1.6.2.9 濾紙法測定:
將滴有20 微升血點全部剪下放入試管中,同時取同樣大小空白濾紙放入標(biāo)準(zhǔn)管和空白管中,各管均加入 5%硅藻土懸濁液 0.2 亳升,振蕩后放置過夜,以下步驟同直接法。
計算:
FEP(微克/100 毫升全血)=C/B×A/D×100
A=標(biāo)準(zhǔn)管原卟啉含量(0.02 毫克)
B=標(biāo)準(zhǔn)管熒光強度-空白管熒光強度
C=血樣熒光強度-空白管熒光強度
D=取樣量
1.6.3 紅細(xì)胞壓積測定:使用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定同“1.6.2.7”。
1.7 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,
結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
結(jié)果判定
受試樣品組與低鐵對照組相比,若血紅蛋白差異有顯著性,且其前后平均升高幅度達(dá)到10g/L 以上,同時,受試樣品紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉或紅細(xì)胞壓積與低鐵對照組相比差異有顯著性,可判定該受試樣品改善缺鐵性貧血動物實驗結(jié)果陽性。
1.8 注意事項
本項實驗關(guān)鍵在于貧血模型的建立。低鐵飼料含鐵量最好控制在9mg/kg 以下,所用試劑應(yīng)為分析純,動物飲用水應(yīng)為去離子水或雙蒸水,采用不銹鋼籠具,所用器皿應(yīng)用 10%硝酸溶液處理。實驗過程中嚴(yán)防外來鐵的污染及彼此交叉污染。
2 人體試食試驗
2.1 受試者納入標(biāo)準(zhǔn)
受試者為小細(xì)胞低色素貧血,且有明確的缺鐵原因和臨床表現(xiàn)的成人和兒童。
2.1.1 成人納入標(biāo)準(zhǔn):男性 Hb 80g/L-130g/L,女性 Hb 80g/L-120g/L。
2.1.2 兒童納入標(biāo)準(zhǔn):≤6 歲兒童 Hb 70g/L-110g/L;7-18 歲青少年 80g/L-120g/L。
2.2 受試者排除標(biāo)準(zhǔn)
2.2.1 合并有心、腦血管、肝、腎、消化道等嚴(yán)重疾病及精神病患者。
2.2.2 過敏體質(zhì)或?qū)υ撌茉嚇悠愤^敏者。
2.2.3 嚴(yán)重貧血患者。
2.2.4 短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品,影響到對結(jié)果的判斷者。
2.2.5 未按標(biāo)準(zhǔn)服用受試樣品、資料不全影響功效或安全性判斷者。
2.3 試驗設(shè)計及分組要求
采用自身和組間兩種對照設(shè)計。按受試者的血紅蛋白水平隨機(jī)分為試食組和對照組,盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如性別、年齡、經(jīng)濟(jì)狀況等,進(jìn)行均衡性檢驗,以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。
2.4 受試樣品的劑量和使用方法
試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產(chǎn)品,對照組可服用安慰劑或采用空白對照,也可服用具有同樣作用的陽性物。受試樣品給予時間30 天,必要時可延長至 120 天。試驗期間不改變原來的飲食習(xí)慣,正常飲食。
2.5 觀察指標(biāo)
2.5.1 安全性指標(biāo)
2.5.1.1 一般狀況(包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等)
2.5.1.2 血、尿、便常規(guī)檢查
2.5.1.3 肝、腎功能檢查(兒童受試者不測定此項)
2.5.1.4 腹部 B 超、胸片、心電圖檢查(各項指標(biāo)在試驗前檢查一次,兒童受試者不測此項)
2.5.2 膳食調(diào)查
于試驗開始前、結(jié)束前進(jìn)行三天的詢問法膳食調(diào)查,觀察飲食因素對試驗結(jié)果的影響。
2.5.3 癥狀觀察
食欲不振、乏力、煩躁、頭暈、眼花、精神不集中、心慌、氣短等。
2.5.4 功效性指標(biāo)
兒童觀察指標(biāo):血紅蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉
成人觀察指標(biāo):血紅蛋白、血清鐵蛋白、血清運鐵蛋白飽和度/紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉
2.5.4.1 血紅蛋白測定:見 1.6.1。
2.5.4.2 血清鐵蛋白測定(放射免疫法):
2.5.4.2.1 原理
人血清中的鐵蛋白(SF)與加入的 125I 標(biāo)記的 SF 競爭性地與抗鐵蛋白抗體結(jié)合。用第二抗體分離結(jié)合
部分,分別測定總放射性與沉淀物放射性計數(shù)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SF 試劑作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而可在曲線上查出相應(yīng)
樣品血清的SF 濃度。
2.5.4.2.2 儀器
離心機(jī)、γ-射線計數(shù)儀。
2.5.4.2.3 試劑
125I-血清鐵蛋白放射免疫分析試劑盒.。
2.5.4.2.4 操作步驟
2.5.4.2.4.1 操作步驟:鐵蛋白測定操作程序和試劑用量(mL)
(見下表)
2.5.4.2.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
以各標(biāo)準(zhǔn)管的B/ B0 %作縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)鐵蛋白濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)邊)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品或質(zhì)控由 B/ B0 %
值從曲線上查到相應(yīng)的含量。
2.5.4.2.4.3 結(jié)果計算
2.5.4.2.4.4 注意事項
本實驗為抗原抗體結(jié)合反應(yīng),操作時要注意防止可引起抗原、抗體失活的因素(如高溫、冰凍等)。
測定時,要防止液體濺出,以免造成同位素污染,使本底值增高。
離心后,抽去上清液時勿將平鋪在管底的免疫復(fù)合物吸起,否則測定結(jié)果不準(zhǔn)確。
非特異管、零管是為鑒定試劑是否符合規(guī)定而設(shè)立的。
血清鐵蛋白濃度也可用酶聯(lián)免疫吸附法測定。具體測定方法按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。
2.5.4.3 血清運鐵蛋白飽和度測定
2.5.4.3.1 原理
血清中加入過量的鐵,使血清中的運鐵蛋白全部與鐵結(jié)合,達(dá)到飽和,過剩的鐵用碳酸鎂吸附除去,然后按測血清鐵的方法,測定總結(jié)合的鐵量,即為總鐵結(jié)和力。從中可計算出未飽和鐵量及血清運鐵蛋白飽和度。
2.5.4.3.2 血清鐵測定
血清鐵(SI)是指存在于血清中與血清運鐵蛋白結(jié)合的鐵,它以高鐵的形式附著在血清 pl 球蛋白的轉(zhuǎn)遞蛋白上,成人正常值為 50-184μg/100mL。缺鐵性貧血時常低于 50μg/100mL,當(dāng)血紅蛋白濃度降低不明顯時,血清鐵已減少,被認(rèn)為是早期缺鐵性貧血診斷依據(jù)之一。
2.5.4.3.2.1 鉻天青 B 銨鹽比色法
鉻天青B 銨鹽作為顯色劑測血清鐵,比過去多采用的聯(lián)吡啶等作為顯色劑有較高的靈敏度,其克分子吸光系數(shù)在 630nm 波長下為 1.68×10 5 L·mol -1·cm-1??纱蟠鬁p少樣品血清量,方法簡便,準(zhǔn)確。
2.5.4.3.2.1.1 原理
Fe 3/Fe 2 與鉻天青 B(CAB)和十六烷基三甲基溴化銨(CTMA)反應(yīng),形成三元膠囊狀絡(luò)合物使試劑顏色加深,其顏色加深程度與血清鐵含量成正比,在 pH 為 4.6-5.5,波長為 630nm 時,有最大吸收峰,利用檸檬酸為鐵的掩蔽劑,樣品為自身空白,不需除蛋白,即可測出血清鐵的含量。
2.5.4.3.2.1.2 試劑
2.5.4.3.2.1.2.1 緩沖溶液 pH4.75,取 25g 無水醋酸鈉,110g 氯化鈉,8mL 冰醋酸,用蒸餾水定容至 1000mL。
用酸度計測pH 應(yīng)為 4.75。
2.5.4.3.2.1.2.2 顯色劑
2.5.4.3.2.1.2.2.1 0.1%鉻天青 B 銨鹽溶液(A 液):取 0.1g 鉻天青 B 銨鹽,定容于 l00mL 蒸餾水中,放在棕色瓶中可在室溫下保存 1 個月。
2.5.4.3.2.1.2.2.2 0.3%十六烷基三甲基溴化銨(B 液):取十六烷基三甲基溴化銨 0.3g,用蒸餾水定容至 100mL。
2.5.4.3.2.1.2.2.3 顯色劑應(yīng)用液:取 90mL B 液,60mL A 液,小心混勻,用緩沖溶液定容至 1000mL,放在棕色瓶內(nèi)可保存 1 個月。
2.5.4.3.2.1.2.3 掩蔽劑:稱 17.0g 檸檬酸(C6H8O7·H2O),35.0g 檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·H2O),約加 50mL蒸餾水加熱助溶,冷卻后定容至 l00mL。
2.5.4.3.2.1.2.4 鐵標(biāo)準(zhǔn)液
2.5.4.3.2.1.2.4.1 貯備液:3mmol/L,取 1.176g 硫酸亞鐵銨(6 分子結(jié)晶水)至少量蒸餾水中,加 50mL 濃硝酸混勻反應(yīng) 10 分鐘,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液:30μmol/L,取 10mL 貯備液,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.2.1.3 方法
按下表加入各種試劑。
標(biāo)準(zhǔn)管光密度
2.5.4.3.2.1.5 注意事項
2.5.4.3.2.1.5.1 要求所用器皿用 2N 鹽酸浸泡過夜,試劑純度為分析純以上,所用蒸餾水為雙蒸水或去離子水。
2.5.4.3.2.1.5.2 緩沖液 pH 對結(jié)果影響較大,測定時 pH 應(yīng)保證在 4.70-4.80 之間。
2.5.4.3.2.1.5.3 嚴(yán)格限制波長的選擇(需經(jīng)校下),血清樣品在 607-609nm 之間有一個雜質(zhì)吸收峰。
2.5.4.3.2.2 原子吸收光譜法
用原子吸收光譜法測定生物樣品中微量元素的含量具有操作簡便、快速、靈敏度較高的優(yōu)點,故被廣泛應(yīng)用。
2.5.4.3.2.2.1 試劑
2.5.4.3.2.2.1.1 混合酸消化液:4 份硝酸,1 份高氯酸混合即成。
2.5.4.3.2.2.1.2 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液
2.5.4.3.2.2.1.2.1 鐵標(biāo)貯備液:取 1.0000g 純金屬鐵,用鹽酸或硝酸溶解后,用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL,移入聚乙烯塑料瓶內(nèi),存放在 4℃冰箱,1mL 含 1mg 鐵。
2.5.4.3.2.2.1.2.2 鐵標(biāo)工作液:取 10mL 貯備液,用 0.1N 鹽酸定容至 l00mL,lmL=l00μg 鐵。
2.5.4.3.2.2.2 操作
2.5.4.3.2.2.2.1 樣品收集及處理
取靜脈血2mL 于盛有 l0mg 草酸鉀的 5mL 試管中(于每試管中加入 0.2mL5%草酸鉀,置烘箱中烤干即成),離心(3000 轉(zhuǎn)/分)15 分鐘。將分離出的血漿吸入另一帶蓋小試管中,備用。
2.5.4.3.2.2.2.2 消化
取1.0mL 血漿,于 100mL 高型燒杯中,約加 3mL 混合酸消化液,上蓋表皿,放置數(shù)小時或過夜,在沙浴電熱板上徐徐加熱煮沸,在冒白色濃煙激烈作用后溶液呈無色或淡黃色。反應(yīng)終了,取下燒杯(若酸用量不夠,最后可出現(xiàn)溶液變黑現(xiàn)象,此時可再加 2 mL 混合酸消化液繼續(xù)消化直至五色)。冷卻后用 10-20mL
去離子水沖洗表皿和杯壁,除去表皿繼續(xù)加熱,直到再度冒白色濃煙,待溶液體積接近蒸干,殘留酸量不超過l mL,取下冷卻,用蒸餾水稀釋至 3mL。
2.5.4.3.2.2.2.3 測定
吸取0.0mL,0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,用 0.1N 鹽酸定容至 100mL,混合,各容量瓶中每 mL 分別相當(dāng)于 0μg,0.5μg,1μg,2μg,3μg,5μg 鐵。將處理后的樣液,試劑空白,鐵標(biāo)系列溶液分別導(dǎo)入火焰進(jìn)行測定,測定條件(Pekin-Elener403 型原子吸收分光光度計):波長 248.3nm;空心陰極燈電流:30mA,狹縫寬 0.2mm,空氣流量 13.51/min,乙炔流量:5.21/分。以鐵含量對應(yīng)濃度吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品鐵含量。
2.5.4.3.2.2.2.4 計算
式中:X─ 血漿中鐵的含量(μg/100mL 血清)。
A1─測定用樣品液中鐵的含量(mg/L)。
A2─測定空白液中鐵的含量(mg/L)。
V─樣品處理液定容總體積(mL)。
m─ 血漿取樣量(mL)
2.5.4.3.3 總鐵結(jié)合量測定
2.5.4.3.3.1 試劑
2.5.4.3.3.1.1 鐵標(biāo)準(zhǔn)液
2.5.4.3.3.1.1.1 鉻天青 B 銨鹽法
2.5.4.3.3.1.1.1.1 貯備液:(3mmol/L)取 1.176g 硫酸亞鐵銨(6 分子結(jié)晶水)置蒸餾水中,加 50mL 濃硝酸混勻反應(yīng) 10 分鐘,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.3.1.1.1.2 工作液:(30μmol/L)取 10mL 貯備液,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.3.1.1.2 原子吸收分光光度法
2.5.4.3.3.1.1.2.1 貯備液:取 1.0000g 純金屬鐵,用鹽酸或硝酸溶解后,用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL,移入聚乙烯塑料瓶內(nèi),存放 4 oC 冰箱,1mL 含 1mg 鐵。
2.5.4.3.3.1.1.2.2 工作液:取 10mL 貯備液,用 0.1N 鹽酸定容至 100mL,1mL=100μg 鐵。
2.5.4.3.3.2 輕質(zhì)碳酸鎂(AR)(或堿式碳酸鎂)其質(zhì)量應(yīng)符合要求。
2.5.4.3.3.3 實驗步驟
2.5.4.3.3.3.1 應(yīng)用鉻天青 B 銨鹽方法測總鐵結(jié)合量
取0.1mL 血清放入尖底離心管,加 60μmol/L 鐵標(biāo)準(zhǔn)液0.1mL 充分混合,室溫放置 15 分鐘。再加 4-5mg 輕質(zhì)碳酸鎂,放置 15 分鐘,混合 3-4 次。然后以 3000轉(zhuǎn)/分離心 5-8 分鐘,取上清液 0.1mL 按鉻天青 B 銨鹽比色法測血清鐵的步驟進(jìn)行操作,計算。
2.5.4.3.3.3.2 原子吸收分光光度法測總鐵結(jié)合量取 1.0mL 血清,加鐵標(biāo)準(zhǔn)液(20μg/mL)0.5mL,充分混合,放置 15 分鐘。加 150mg 輕質(zhì)碳酸鎂,充分混勻 1 分鐘以上,放置 30 分鐘,混合 3-4 次。離心 10 分鐘,取上清液 1mL 按原子吸收分光光度法測血清鐵的操作步驟進(jìn)行消化,測定,計算。
2.5.4.3.3.4 計算
2.5.4.3.3.4.1 血清總鐵結(jié)合量可用(mg/100L)表示。
2.5.4.3.3.4.2 未飽和鐵量=血清總鐵結(jié)合量-血清鐵。
2.5.4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
2.5.4.4 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉:見 1.6.2。
2.5.5 結(jié)果判定
受試樣品組與對照組比較,血紅蛋白升高且平均升高幅度≥10g/L,血清鐵蛋白增加,血清運鐵蛋白飽和度升高,紅細(xì)胞游離原卟啉降低,經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性,即可分別判定該指標(biāo)結(jié)果陽性。
2.6 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
試驗數(shù)據(jù)為計量資料,可用t 檢驗進(jìn)行分析。凡自身對照資料可以采用配對 t 檢驗,兩組均數(shù)比較采用成組 t 檢驗,后者需進(jìn)行方差齊性檢驗,對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)方差齊后,用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行 t 檢驗;若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求,改用 t'檢驗或秩和檢驗;但變異系數(shù)太大(如 CV>50%)的資料應(yīng)用秩和檢驗。
結(jié)果判定
改善兒童缺鐵性貧血:試驗前后自身比較和試驗后組間比較,血紅蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉二項指標(biāo)差異有顯著性;同時,試食組自身前后比較,血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L,可判定受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。
改善成人缺鐵性貧血:試驗前后自身比較和試驗后組間比較,血紅蛋白指標(biāo)差異有顯著性;同時,試食組自身前后比較,血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L,血清鐵蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度二項指標(biāo)中一項指標(biāo)陽性,可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。
歐際醫(yī)藥依托擁有實驗動物使用許可證的實驗動物中心進(jìn)行合作,為您提供主要包括模型制備、受試物給藥、標(biāo)本采集、功能指標(biāo)檢測等技術(shù)服務(wù)。
服務(wù)目錄號:#OGF-011
服務(wù)項目:改善缺鐵性貧血功能評價
1 動物實驗
1.1 原理
用低鐵飼料喂飼動物可形成實驗性缺鐵性貧血模型,再給予受試樣品,觀察其對血液細(xì)胞學(xué)、血液生化
學(xué)等指標(biāo)的影響,可判定該受試樣品對改善動物缺鐵性貧血的作用。
1.2 實驗動物
健康初斷乳大鼠,單一性別,每組大鼠8-12 只。
1.3 低鐵飼料
配方:
1.4 劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設(shè)三個劑量組和一個低鐵對照組,以人體推薦量的5 倍為其中的一個劑量組,另設(shè)二個劑量組,必要時設(shè)陽性對照組(硫酸亞鐵或乳酸亞鐵,劑量為 2 ppm 或 2 mg/kg BW,以 Fe 元素計)。受試樣品給予時間 30天,必要時可延長至 45 天。
1.5 實驗步驟
1.5.1 建立缺鐵性貧血大鼠模型
選用健康斷乳大鼠在實驗環(huán)境下適應(yīng)3-5 天后飼予低鐵飼料及去離子水(或雙蒸水),采用不銹鋼籠及食罐,同時,采用剪尾取血法放血,5 天一次,每次 0.3-0.5ml。實驗過程中避免鐵污染。自第 3 周開始每周選取部分大鼠采尾血測 Hb,如多數(shù)動物 Hb 低于 100g/L 時,測定全部大鼠的體重及 Hb。
1.5.2 恢復(fù)實驗
選取Hb<100g/L 的大鼠作為實驗動物,根據(jù)貧血大鼠 Hb 水平和體重將其隨機(jī)分為低鐵對照組和三個實驗組,各組均繼續(xù)飼予低鐵飼料,低鐵對照組給予相應(yīng)溶劑,實驗組分別給予不同劑量的受試樣品,受試樣品給予時間 30 天,必要時可延長至 45 天,測定體重及各項血液學(xué)指標(biāo)。
1.6 觀察指標(biāo)
體重、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積/紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉。
1.6.1 血紅蛋白測定(氰化高鐵法)
消光系數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法任選其一測定血紅蛋白。在滿足實驗方案和儀器要求的前提下,也可采用血液分析儀測定。
1.6.1.1 吸光系數(shù)法
1.6.1.1.1 原理
血紅蛋白(haemoglobin,Hb)被鐵氰化鉀氧化后生成高鐵血紅蛋白,再與氰離子結(jié)合形成氰化高鐵血紅蛋白(紅色), 氰化高鐵血紅蛋白(紅色)極為穩(wěn)定,在 540nm 波長下,摩爾吸光系數(shù)為 44000,據(jù)此,用分光光度法測其光密度,運用吸光系數(shù)作血紅蛋白的定量測定。
1.6.1.1.2 儀器
分光光度計。
10 微升微量吸管。
1.6.1.1.3 試劑
稱取碳酸氫鈉(NaHCO3,AR)140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg,用水溶解并稀釋到 1000mL。貯存于棕色試劑瓶內(nèi),在暗處或冰箱(4℃)保存,至少可穩(wěn)定數(shù)月到 1 年。
1.6.1.1.4 實驗步驟
1.6.1.1.4.1 取試劑 2.5mL 于 5mL 帶蓋試管中,加入 10μL 血液,混勻后,放置 15 分鐘。
1.6.1.1.4.2 選用 0.5 厘米光徑比色杯,于 540nm 波長下,以試劑調(diào)零點,將所得樣品管之光密度乘以 736,
即為血紅蛋白濃度(g/L)。
計算公式如下:
Ct=待測的血紅蛋白(g/L)濃度。
= 氰化高鐵血紅蛋白在 540nm 波長下測出的光密度。
251 = 測定時血液的稀釋倍數(shù)(血 10μL 加入試劑 2.5mL 中)
44000 = 氰化高鐵血紅蛋白的摩爾吸光系數(shù)
0.5 = 比色杯的光徑
64458 = 血紅蛋白的分子量
1.6.1.1.5 注意事項
1.6.1.1.5.1 試劑不要放在聚乙烯瓶內(nèi),以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。
1.6.1.1.5.2 儀器因摩爾吸光系數(shù)法完全依靠儀器的吸光度來計算,故此法要求所用的儀器性能要符合要求(如儀器的波長準(zhǔn)確與否,以及靈敏度及線性等),否則將直接影響測定的結(jié)果。
1.6.1.1.5.3 儀器在使用前最好應(yīng)以 WHO 規(guī)定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正后再使用。參考液最好選用ICSH(國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會)確定的由 RIV(荷蘭國立公共衛(wèi)生研究院)制作的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫(yī)學(xué)化驗所制備的氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。
1.6.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法
1.6.1.2.1 原理
血紅蛋白(hemoglobin,Hb)在鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下生成極為穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白(紅色),其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計在 540nm 波長下,測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,測得待測樣品的吸光度后查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得 Hb 的濃度。
1.6.1.2.2 儀器
10μL 血色素吸管(或定量毛細(xì)管)
5mL 或 10mL 帶蓋試管
分光光度計1.6.1.2.3 試劑
稱取碳酸氫鈉(NaHCO3,AR)140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg,用蒸餾水溶解并稀釋到 1000mL, 貯存于棕色試劑瓶內(nèi),保存于 4℃冰箱可穩(wěn)定至 1 年。
1.6.1.2.4 實驗步驟
吸取2.5mL 試劑于 5mL 帶蓋試管中,用 10μL 血色素吸管(或定量毛細(xì)管)取大鼠尾血或靜脈血 10μL放置于已放入試劑的試管中;混勻放置 15min。選用 0.5cm 光徑比色杯,于 540nm 波長下,以試劑調(diào)節(jié)儀器零點,測定各樣品管的吸光度,同時測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度,繪制血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
查標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得待測樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的血紅蛋白含量(g/L),計算參考物質(zhì)的回收率。
1.6.1.2.5 注意事項
1.6.1.2.5.1 不要將試劑放在聚乙烯瓶內(nèi),以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。
1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系數(shù)方法計算血紅蛋白的含量,因為儀器的波長準(zhǔn)確與否、儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測定結(jié)果。
1.6.1.2.5.3 每次測定時,在不同間隔反復(fù)測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(低、中、高 3 個濃度)。
1.6.1.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
結(jié)果判定
受試樣品組與對照組比較,血紅蛋白濃度升高經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性,且受試樣品組前后升高幅度平均達(dá)到10g/L 以上,判定該實驗結(jié)果陽性。
1.6.2 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉測定
1.6.2.1 原理
血紅蛋白的合成過程中,幼紅細(xì)胞中的原卟啉在血紅素合成酶的作用下與鐵結(jié)合,當(dāng)鐵供應(yīng)不足時,紅細(xì)胞內(nèi)的原卟啉乃以游離形式累積起來超過正常水平。因此,檢測紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉(Free erythrocyteproloporphyrin,F(xiàn)EP)的含量是檢查缺鐵性紅細(xì)胞生成的有效方法。
血液樣品經(jīng)生理鹽水稀釋后,分別以乙酸乙酯:乙酸混合液(4:1)和 0.5N 鹽酸提取分離血中游離原卟啉,在一定波長下測定其原卟啉的熒光強度而定量。
1.6.2.2 儀器
1.6.2.2.1 熒光分光光度計或 930 型熒光光度計。
1.6.2.2.2 離心機(jī)。
1.6.2.2.3 混旋器。
1.6.2.3 試劑
1.6.2.3.1 肝素抗凝劑 一支 12500 單位的肝素以 0.9%生理鹽水稀釋至 25mL(1mL=500 單位)。
1.6.2.3.2 5 %(W/V)硅藻土生理鹽水懸濁液 稱取 5g 硅藻土加 0.9%生理鹽水至 100mL。
1.6.2.3.3 4:1 乙酸乙酯和乙酸混合液。
1.6.2.3.4 0.5N HCl。
1.6.2.3.5 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)液。
1.6.2.3.5.1 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)貯備液(50mg/L):稱取5mg 原卟啉,加4mL 無水乙醇使之溶解,以 1.5N HCl 稀釋至100mL。
1.6.2.3.5.2 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0mg/L):取2mL 原卟啉貯備液,以乙酸乙酯與乙酸(4:1)混合液稀釋到100mL。
1.6.2.3.5.3 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.1mg/L):取1mL 原卟啉中間液,以乙酸乙酯與乙酸(4:1)混合液稀釋到10mL。
1.6.2.4 實驗步驟
注:按上表依次加入各種試劑,在加入乙酸乙酯與乙酸混合液前,用混旋器混合已加入的混合液,然后邊混合邊加入乙酸乙酯與乙酸混合液。
離心15 分鐘,將各管上清液分別倒入 10mL 比色管中,每管加 4mL 0.5N 鹽酸,振搖 5 分鐘靜止使之分層,將上層溶劑抽出棄去,測定鹽酸液的熒光強度(30 分鐘內(nèi)比色)。
1.6.2.5 熒光測量
1.6.2.5.1 若使用日立 MPF-4型熒光分光光度計測定條件為激發(fā)波長為 403nm,狹縫10nm;發(fā)射波長為 605nm,狹縫為 5nm,液槽為 1cm 厚石英槽。
1.6.2.5.2 若使用國產(chǎn) 930 型熒光光度計測試,條件為激發(fā)濾光片 420,熒光濾片 550,靈敏度1×500,滿度開關(guān)開至最大,液槽為 1cm 厚石英槽,檢出靈敏度為 0.01μg/4mL。在不同量原卟啉(0μg,0.01μg,0.03μg,0.05μg,0.07μg,0.1μg)呈線性關(guān)系。
1.6.2.6 計算
1.6.2.7 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
結(jié)果判定
受試樣品組與對照組比較,紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉降低經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性,即可判定該實驗結(jié)果陽性。
1.6.2.8 注意事項
1.6.2.8.1 熒光強度隨時間延長而逐漸衰退,但 30 分鐘內(nèi)基本穩(wěn)定。
1.6.2.8.2 加乙酸乙酯-乙酸混合液時,一定要邊混合邊加入,否則影響測定結(jié)果。
1.6.2.9 濾紙法測定:
將滴有20 微升血點全部剪下放入試管中,同時取同樣大小空白濾紙放入標(biāo)準(zhǔn)管和空白管中,各管均加入 5%硅藻土懸濁液 0.2 亳升,振蕩后放置過夜,以下步驟同直接法。
計算:
FEP(微克/100 毫升全血)=C/B×A/D×100
A=標(biāo)準(zhǔn)管原卟啉含量(0.02 毫克)
B=標(biāo)準(zhǔn)管熒光強度-空白管熒光強度
C=血樣熒光強度-空白管熒光強度
D=取樣量
1.6.3 紅細(xì)胞壓積測定:使用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定同“1.6.2.7”。
1.7 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,
結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
結(jié)果判定
受試樣品組與低鐵對照組相比,若血紅蛋白差異有顯著性,且其前后平均升高幅度達(dá)到10g/L 以上,同時,受試樣品紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉或紅細(xì)胞壓積與低鐵對照組相比差異有顯著性,可判定該受試樣品改善缺鐵性貧血動物實驗結(jié)果陽性。
1.8 注意事項
本項實驗關(guān)鍵在于貧血模型的建立。低鐵飼料含鐵量最好控制在9mg/kg 以下,所用試劑應(yīng)為分析純,動物飲用水應(yīng)為去離子水或雙蒸水,采用不銹鋼籠具,所用器皿應(yīng)用 10%硝酸溶液處理。實驗過程中嚴(yán)防外來鐵的污染及彼此交叉污染。
2 人體試食試驗
2.1 受試者納入標(biāo)準(zhǔn)
受試者為小細(xì)胞低色素貧血,且有明確的缺鐵原因和臨床表現(xiàn)的成人和兒童。
2.1.1 成人納入標(biāo)準(zhǔn):男性 Hb 80g/L-130g/L,女性 Hb 80g/L-120g/L。
2.1.2 兒童納入標(biāo)準(zhǔn):≤6 歲兒童 Hb 70g/L-110g/L;7-18 歲青少年 80g/L-120g/L。
2.2 受試者排除標(biāo)準(zhǔn)
2.2.1 合并有心、腦血管、肝、腎、消化道等嚴(yán)重疾病及精神病患者。
2.2.2 過敏體質(zhì)或?qū)υ撌茉嚇悠愤^敏者。
2.2.3 嚴(yán)重貧血患者。
2.2.4 短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品,影響到對結(jié)果的判斷者。
2.2.5 未按標(biāo)準(zhǔn)服用受試樣品、資料不全影響功效或安全性判斷者。
2.3 試驗設(shè)計及分組要求
采用自身和組間兩種對照設(shè)計。按受試者的血紅蛋白水平隨機(jī)分為試食組和對照組,盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如性別、年齡、經(jīng)濟(jì)狀況等,進(jìn)行均衡性檢驗,以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。
2.4 受試樣品的劑量和使用方法
試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產(chǎn)品,對照組可服用安慰劑或采用空白對照,也可服用具有同樣作用的陽性物。受試樣品給予時間30 天,必要時可延長至 120 天。試驗期間不改變原來的飲食習(xí)慣,正常飲食。
2.5 觀察指標(biāo)
2.5.1 安全性指標(biāo)
2.5.1.1 一般狀況(包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等)
2.5.1.2 血、尿、便常規(guī)檢查
2.5.1.3 肝、腎功能檢查(兒童受試者不測定此項)
2.5.1.4 腹部 B 超、胸片、心電圖檢查(各項指標(biāo)在試驗前檢查一次,兒童受試者不測此項)
2.5.2 膳食調(diào)查
于試驗開始前、結(jié)束前進(jìn)行三天的詢問法膳食調(diào)查,觀察飲食因素對試驗結(jié)果的影響。
2.5.3 癥狀觀察
食欲不振、乏力、煩躁、頭暈、眼花、精神不集中、心慌、氣短等。
2.5.4 功效性指標(biāo)
兒童觀察指標(biāo):血紅蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉
成人觀察指標(biāo):血紅蛋白、血清鐵蛋白、血清運鐵蛋白飽和度/紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉
2.5.4.1 血紅蛋白測定:見 1.6.1。
2.5.4.2 血清鐵蛋白測定(放射免疫法):
2.5.4.2.1 原理
人血清中的鐵蛋白(SF)與加入的 125I 標(biāo)記的 SF 競爭性地與抗鐵蛋白抗體結(jié)合。用第二抗體分離結(jié)合
部分,分別測定總放射性與沉淀物放射性計數(shù)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SF 試劑作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而可在曲線上查出相應(yīng)
樣品血清的SF 濃度。
2.5.4.2.2 儀器
離心機(jī)、γ-射線計數(shù)儀。
2.5.4.2.3 試劑
125I-血清鐵蛋白放射免疫分析試劑盒.。
2.5.4.2.4 操作步驟
2.5.4.2.4.1 操作步驟:鐵蛋白測定操作程序和試劑用量(mL)
(見下表)
2.5.4.2.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
以各標(biāo)準(zhǔn)管的B/ B0 %作縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)鐵蛋白濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)邊)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品或質(zhì)控由 B/ B0 %
值從曲線上查到相應(yīng)的含量。
2.5.4.2.4.3 結(jié)果計算
2.5.4.2.4.4 注意事項
本實驗為抗原抗體結(jié)合反應(yīng),操作時要注意防止可引起抗原、抗體失活的因素(如高溫、冰凍等)。
測定時,要防止液體濺出,以免造成同位素污染,使本底值增高。
離心后,抽去上清液時勿將平鋪在管底的免疫復(fù)合物吸起,否則測定結(jié)果不準(zhǔn)確。
非特異管、零管是為鑒定試劑是否符合規(guī)定而設(shè)立的。
血清鐵蛋白濃度也可用酶聯(lián)免疫吸附法測定。具體測定方法按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。
2.5.4.3 血清運鐵蛋白飽和度測定
2.5.4.3.1 原理
血清中加入過量的鐵,使血清中的運鐵蛋白全部與鐵結(jié)合,達(dá)到飽和,過剩的鐵用碳酸鎂吸附除去,然后按測血清鐵的方法,測定總結(jié)合的鐵量,即為總鐵結(jié)和力。從中可計算出未飽和鐵量及血清運鐵蛋白飽和度。
2.5.4.3.2 血清鐵測定
血清鐵(SI)是指存在于血清中與血清運鐵蛋白結(jié)合的鐵,它以高鐵的形式附著在血清 pl 球蛋白的轉(zhuǎn)遞蛋白上,成人正常值為 50-184μg/100mL。缺鐵性貧血時常低于 50μg/100mL,當(dāng)血紅蛋白濃度降低不明顯時,血清鐵已減少,被認(rèn)為是早期缺鐵性貧血診斷依據(jù)之一。
2.5.4.3.2.1 鉻天青 B 銨鹽比色法
鉻天青B 銨鹽作為顯色劑測血清鐵,比過去多采用的聯(lián)吡啶等作為顯色劑有較高的靈敏度,其克分子吸光系數(shù)在 630nm 波長下為 1.68×10 5 L·mol -1·cm-1??纱蟠鬁p少樣品血清量,方法簡便,準(zhǔn)確。
2.5.4.3.2.1.1 原理
Fe 3/Fe 2 與鉻天青 B(CAB)和十六烷基三甲基溴化銨(CTMA)反應(yīng),形成三元膠囊狀絡(luò)合物使試劑顏色加深,其顏色加深程度與血清鐵含量成正比,在 pH 為 4.6-5.5,波長為 630nm 時,有最大吸收峰,利用檸檬酸為鐵的掩蔽劑,樣品為自身空白,不需除蛋白,即可測出血清鐵的含量。
2.5.4.3.2.1.2 試劑
2.5.4.3.2.1.2.1 緩沖溶液 pH4.75,取 25g 無水醋酸鈉,110g 氯化鈉,8mL 冰醋酸,用蒸餾水定容至 1000mL。
用酸度計測pH 應(yīng)為 4.75。
2.5.4.3.2.1.2.2 顯色劑
2.5.4.3.2.1.2.2.1 0.1%鉻天青 B 銨鹽溶液(A 液):取 0.1g 鉻天青 B 銨鹽,定容于 l00mL 蒸餾水中,放在棕色瓶中可在室溫下保存 1 個月。
2.5.4.3.2.1.2.2.2 0.3%十六烷基三甲基溴化銨(B 液):取十六烷基三甲基溴化銨 0.3g,用蒸餾水定容至 100mL。
2.5.4.3.2.1.2.2.3 顯色劑應(yīng)用液:取 90mL B 液,60mL A 液,小心混勻,用緩沖溶液定容至 1000mL,放在棕色瓶內(nèi)可保存 1 個月。
2.5.4.3.2.1.2.3 掩蔽劑:稱 17.0g 檸檬酸(C6H8O7·H2O),35.0g 檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·H2O),約加 50mL蒸餾水加熱助溶,冷卻后定容至 l00mL。
2.5.4.3.2.1.2.4 鐵標(biāo)準(zhǔn)液
2.5.4.3.2.1.2.4.1 貯備液:3mmol/L,取 1.176g 硫酸亞鐵銨(6 分子結(jié)晶水)至少量蒸餾水中,加 50mL 濃硝酸混勻反應(yīng) 10 分鐘,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液:30μmol/L,取 10mL 貯備液,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.2.1.3 方法
按下表加入各種試劑。
標(biāo)準(zhǔn)管光密度
2.5.4.3.2.1.5 注意事項
2.5.4.3.2.1.5.1 要求所用器皿用 2N 鹽酸浸泡過夜,試劑純度為分析純以上,所用蒸餾水為雙蒸水或去離子水。
2.5.4.3.2.1.5.2 緩沖液 pH 對結(jié)果影響較大,測定時 pH 應(yīng)保證在 4.70-4.80 之間。
2.5.4.3.2.1.5.3 嚴(yán)格限制波長的選擇(需經(jīng)校下),血清樣品在 607-609nm 之間有一個雜質(zhì)吸收峰。
2.5.4.3.2.2 原子吸收光譜法
用原子吸收光譜法測定生物樣品中微量元素的含量具有操作簡便、快速、靈敏度較高的優(yōu)點,故被廣泛應(yīng)用。
2.5.4.3.2.2.1 試劑
2.5.4.3.2.2.1.1 混合酸消化液:4 份硝酸,1 份高氯酸混合即成。
2.5.4.3.2.2.1.2 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液
2.5.4.3.2.2.1.2.1 鐵標(biāo)貯備液:取 1.0000g 純金屬鐵,用鹽酸或硝酸溶解后,用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL,移入聚乙烯塑料瓶內(nèi),存放在 4℃冰箱,1mL 含 1mg 鐵。
2.5.4.3.2.2.1.2.2 鐵標(biāo)工作液:取 10mL 貯備液,用 0.1N 鹽酸定容至 l00mL,lmL=l00μg 鐵。
2.5.4.3.2.2.2 操作
2.5.4.3.2.2.2.1 樣品收集及處理
取靜脈血2mL 于盛有 l0mg 草酸鉀的 5mL 試管中(于每試管中加入 0.2mL5%草酸鉀,置烘箱中烤干即成),離心(3000 轉(zhuǎn)/分)15 分鐘。將分離出的血漿吸入另一帶蓋小試管中,備用。
2.5.4.3.2.2.2.2 消化
取1.0mL 血漿,于 100mL 高型燒杯中,約加 3mL 混合酸消化液,上蓋表皿,放置數(shù)小時或過夜,在沙浴電熱板上徐徐加熱煮沸,在冒白色濃煙激烈作用后溶液呈無色或淡黃色。反應(yīng)終了,取下燒杯(若酸用量不夠,最后可出現(xiàn)溶液變黑現(xiàn)象,此時可再加 2 mL 混合酸消化液繼續(xù)消化直至五色)。冷卻后用 10-20mL
去離子水沖洗表皿和杯壁,除去表皿繼續(xù)加熱,直到再度冒白色濃煙,待溶液體積接近蒸干,殘留酸量不超過l mL,取下冷卻,用蒸餾水稀釋至 3mL。
2.5.4.3.2.2.2.3 測定
吸取0.0mL,0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,用 0.1N 鹽酸定容至 100mL,混合,各容量瓶中每 mL 分別相當(dāng)于 0μg,0.5μg,1μg,2μg,3μg,5μg 鐵。將處理后的樣液,試劑空白,鐵標(biāo)系列溶液分別導(dǎo)入火焰進(jìn)行測定,測定條件(Pekin-Elener403 型原子吸收分光光度計):波長 248.3nm;空心陰極燈電流:30mA,狹縫寬 0.2mm,空氣流量 13.51/min,乙炔流量:5.21/分。以鐵含量對應(yīng)濃度吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品鐵含量。
2.5.4.3.2.2.2.4 計算
式中:X─ 血漿中鐵的含量(μg/100mL 血清)。
A1─測定用樣品液中鐵的含量(mg/L)。
A2─測定空白液中鐵的含量(mg/L)。
V─樣品處理液定容總體積(mL)。
m─ 血漿取樣量(mL)
2.5.4.3.3 總鐵結(jié)合量測定
2.5.4.3.3.1 試劑
2.5.4.3.3.1.1 鐵標(biāo)準(zhǔn)液
2.5.4.3.3.1.1.1 鉻天青 B 銨鹽法
2.5.4.3.3.1.1.1.1 貯備液:(3mmol/L)取 1.176g 硫酸亞鐵銨(6 分子結(jié)晶水)置蒸餾水中,加 50mL 濃硝酸混勻反應(yīng) 10 分鐘,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.3.1.1.1.2 工作液:(30μmol/L)取 10mL 貯備液,用蒸餾水定容至 1000mL。
2.5.4.3.3.1.1.2 原子吸收分光光度法
2.5.4.3.3.1.1.2.1 貯備液:取 1.0000g 純金屬鐵,用鹽酸或硝酸溶解后,用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL,移入聚乙烯塑料瓶內(nèi),存放 4 oC 冰箱,1mL 含 1mg 鐵。
2.5.4.3.3.1.1.2.2 工作液:取 10mL 貯備液,用 0.1N 鹽酸定容至 100mL,1mL=100μg 鐵。
2.5.4.3.3.2 輕質(zhì)碳酸鎂(AR)(或堿式碳酸鎂)其質(zhì)量應(yīng)符合要求。
2.5.4.3.3.3 實驗步驟
2.5.4.3.3.3.1 應(yīng)用鉻天青 B 銨鹽方法測總鐵結(jié)合量
取0.1mL 血清放入尖底離心管,加 60μmol/L 鐵標(biāo)準(zhǔn)液0.1mL 充分混合,室溫放置 15 分鐘。再加 4-5mg 輕質(zhì)碳酸鎂,放置 15 分鐘,混合 3-4 次。然后以 3000轉(zhuǎn)/分離心 5-8 分鐘,取上清液 0.1mL 按鉻天青 B 銨鹽比色法測血清鐵的步驟進(jìn)行操作,計算。
2.5.4.3.3.3.2 原子吸收分光光度法測總鐵結(jié)合量取 1.0mL 血清,加鐵標(biāo)準(zhǔn)液(20μg/mL)0.5mL,充分混合,放置 15 分鐘。加 150mg 輕質(zhì)碳酸鎂,充分混勻 1 分鐘以上,放置 30 分鐘,混合 3-4 次。離心 10 分鐘,取上清液 1mL 按原子吸收分光光度法測血清鐵的操作步驟進(jìn)行消化,測定,計算。
2.5.4.3.3.4 計算
2.5.4.3.3.4.1 血清總鐵結(jié)合量可用(mg/100L)表示。
2.5.4.3.3.4.2 未飽和鐵量=血清總鐵結(jié)合量-血清鐵。
2.5.4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
實驗數(shù)據(jù)可用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊,計算F 值,F(xiàn) 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
2.5.4.4 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉:見 1.6.2。
2.5.5 結(jié)果判定
受試樣品組與對照組比較,血紅蛋白升高且平均升高幅度≥10g/L,血清鐵蛋白增加,血清運鐵蛋白飽和度升高,紅細(xì)胞游離原卟啉降低,經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性,即可分別判定該指標(biāo)結(jié)果陽性。
2.6 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
試驗數(shù)據(jù)為計量資料,可用t 檢驗進(jìn)行分析。凡自身對照資料可以采用配對 t 檢驗,兩組均數(shù)比較采用成組 t 檢驗,后者需進(jìn)行方差齊性檢驗,對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)方差齊后,用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行 t 檢驗;若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求,改用 t'檢驗或秩和檢驗;但變異系數(shù)太大(如 CV>50%)的資料應(yīng)用秩和檢驗。
結(jié)果判定
改善兒童缺鐵性貧血:試驗前后自身比較和試驗后組間比較,血紅蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉二項指標(biāo)差異有顯著性;同時,試食組自身前后比較,血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L,可判定受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。
改善成人缺鐵性貧血:試驗前后自身比較和試驗后組間比較,血紅蛋白指標(biāo)差異有顯著性;同時,試食組自身前后比較,血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L,血清鐵蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度二項指標(biāo)中一項指標(biāo)陽性,可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。